导语

脓毒症可发展为致命的器官衰竭，这是由对感染的不受控制的免疫反应引起的，并且与高发病率和死亡率相关。早期诊断以便在器官功能障碍之前早期干预对提高脓毒症的存活率至关重要。

背景介绍

今天小编为大家带来的这篇文章，作者通过机器学习算法筛选了导致脓毒症免疫功能障碍的差异表达的脂质代谢相关基因 (DE-LMRG)。文章发表在《Frontiers in Immunology》上，影响因子为：8.786，文章题目为：Integrative single-cell RNA sequencing and metabolomics decipher the imbalanced lipidmetabolism in maladaptive immune responses during sepsis。

数据介绍

本研究包括30名脓毒症患者与15名年龄匹配的健康对照。从GEO数据库中获取了三个数据集的mRNA数据，从 KEGG、Reactome 和 Uniprot 数据库中获得了脂质代谢相关基因 (LMRG)。

技术路线      

本研究技术路线如图1所示。

结果解析 

01通过各种机器算法筛选脓毒症中与脂质代谢相关的中枢基因 

PCA 结果显示，脓毒症患者和健康对照者的基因表达模式存在显著差异（图 2A）。与健康对照组相比，GSE65682共涉及508个差异表达的脂质代谢相关基因（DE-LMRGs），其中上调307个，下调201个（图2B）。基于 GO 分析，CC 显示这些 DE-LMRG 中有 56.5% 分布在细胞质中，23% 分布在细胞质中，20.3% 分布在内质网中（图 2C）。排名前 10 位的分子功能 (MF) 包括催化活性、丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酰基转移酶活性、脂质激酶活性等（图 2D）。此外，DE-LMRGs 的前 10 条生物通路 (BP) 显示在图 2E 中，包括脂质和脂蛋白的代谢、TNF 受体信号通路、脂肪酸和酮体代谢以及 IL1 介导的信号事件。

接下来执行 WGCNA 以发现疑似脓毒症模块。选择 b=5 的软阈值以确保网络无标度（图 3A）。模块 eigengenes (MEs) 被确定为每个基因模块的第一主要成分。然后本研究寻找 ME 与疾病、年龄和性别之间的相关性，以确定败血症相关模块。蓝色模块与脓毒症的相关性最高（图 3B），图3C显示了蓝色模块中的基因。本研究建立 LASSO 逻辑回归以将回归系数缩小为零并选择出 DE-LMRGs。如图 3D、E 所示，本研究总共筛选了 23 个 DE-LMRGs。同样，RF 还构建了用于 DE-LMRGs 筛选的最小误差回归树（图 3F、G），并筛选了 21 个 DE-LMRGs。通过这 3 种方法（WGCNA、LASSO 和 RF）的交叉，本研究确定了 5 个中枢基因（MAPK14、EPHX2、BMX、FCER1A 和 PAFAH2）（图 3H）。然后，分别在训练队列 (GSE65682) 和合并验证队列 (GSE95233 和 GSE54514) 中验证了这 5 个中枢基因的表达（图 3I、J）。 ROC 曲线表明，这些中枢基因在训练队列 GSE65682 中具有出色的脓毒症预测能力，AUC 比率 > 90%（图 3K）。在合并的验证队列中，MAPK 14、EPHX2、BMX、FCER1A 和 PAFAH2 的预测能力通过 AUC 进行验证（图 3L）。

02脂质代谢相关的hub基因可能影响脓毒症免疫细胞浸润 

本研究分析了 SP 和 HC 之间的免疫细胞浸润。首先，CIBERSORT 在训练数据集 GSE65682 的每个样本中分析了免疫细胞比例比较（图 4A）。接下来，正如 Pearson 研究所显示的那样（图 4B），3 个中枢基因（PAFAH2、EPHX2、FCER1A）与 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、静息 NK 细胞和调节性 T 细胞之间存在正相关。相比之下，其他 2 个中枢基因（MAPK14 和 BMX）与 M1 巨噬细胞、M2 巨噬细胞、单核细胞和活化的肥大细胞呈正相关。上述结果也得到了 ssGSEA 算法的验证（图 4C、D），表明脓毒症中存在免疫抑制微环境，这可能为免疫治疗提供新的策略。

03MAPK14参与脓毒症单核细胞的分化 

为了在单细胞水平上进一步研究这些中枢基因的免疫细胞景观，本研究从 GSE167363下载了 scRNA-seq 数据，以探索脓毒症中的亚群 。在 UMAP 图中本研究获得了 7 个细胞簇（浆细胞样树突状细胞、红细胞、中性粒细胞、血小板、单核细胞、T 细胞和 B 细胞），它们在 HC 和 SP 之间分布不均（图 5A），每个簇的前 5 个标记在气泡图中可视化（图 5B）。

为了鉴定脓毒症中免疫细胞的亚型，本研究分别聚集了 T 细胞、B 细胞和单核细胞。确定了 T 细胞的五个亚群，包括 Treg、NK、CD8+ Teff、NK T 细胞和幼稚 T 细胞，它们在 SP 和 HC 之间分布不均（图 5C）。确定了 B 细胞的三个亚群，包括浆细胞、记忆 B 细胞和幼稚 B 细胞（图 5D）。鉴定了三个单核细胞亚群，包括 DC、非经典单核细胞和经典单核细胞，非经典单核细胞的比例在 SP 中高于在 HC 中（图 5E）。从来自 HC和 SP（图 5F）的细胞亚群的配体受体对热图中，本研究发现单核细胞群（DC、非经典单核细胞和经典单核细胞）含有最大数量的在 SP 和 HC 中与其他相邻细胞的细胞间串扰。然后，每个亚群中 5 个中枢基因（PAFAH2、MAPK14、EPHX2、FCER1A 和 BMX）的表达分别如图 5G 所示。所有这些中枢基因在 SP 和 HC 之间显示出显著差异，表明脂质代谢相关基因可能在脓毒症期间的大多数免疫细胞亚群中发挥关键作用。

由于单核细胞在细胞通讯中起着至关重要的作用，本研究通过 Monocle 通过轨迹和伪时间分析进一步研究了细胞分化。经典单核细胞首先发育成非经典单核细胞，非经典单核细胞进一步发育成DC。在 SP 中，可以检测到细胞的所有 3 种状态，而在 HC 中仅发现状态 1（图 6A-D）。有趣的是，中枢基因之一 MAPK14 同时存在于所有州（图 6E）。本研究沿着伪时间轨迹的主干确定了 DEG，并且在聚类和表达动力学中显示了前 30 个具有代表性的 DEG（图 6F）。表达 MAPK14 的簇中的细胞被标记为“阳性”；否则，细胞被标记为“阴性”。热图中显示了 HC 和 SP 中非经典单核细胞（阳性）和非经典 mo（阴性）细胞之间的前 40 个 DEG（图 6G，H）。基于 GO 分析，SP 中非经典单核细胞和非经典运动细胞之间的 DEG 生物学过程被鉴定为体液免疫反应、突触修剪和免疫球蛋白介导的免疫反应（图 6I，J）。通过GSVA分析，本研究检测到非经典单核细胞（阳性）中上调的通路是B细胞受体信号通路、氧化磷酸化等（图6K）。

04MAPK14在脓毒症患者、大鼠和LPS诱导的心肌细胞中的作用 

第一段落：第一行空两格，字体选择15px，字间距选择1（1-2），行间距1.5(1.75-2)，两端缩进尺寸为1.0px(两侧边距5-20)

第一段落：第一行空两格，字体选择15px，字间距选择1（1-2），行间距1.5(1.75-2)，两端缩进尺寸为1.0px(两侧边距5-20)

为了验证唯一参与脓毒症中所有单核细胞分化状态的枢纽基因MAPK14的作用，本研究采用UHPLC-MS系统进行代谢组学研究。 PCA 得分图表明两组样本具有显著差异，并且基本处于 95% 置信区间内（图 7A）。然后建立正交偏最小二乘法判别分析 (OPLS-DA) 以识别两组的模式并探索差异表达的代谢物 (DEM)（图 7B）。共获得449个DEM，其中脓毒症组309个上调，140个下调，饼图显示DEM的超分类（图7C –E）。DEM 富集于苯丙氨酸代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及丙酮酸代谢等通路（图 7F）。SVM 共鉴定出 16 种中枢代谢物（图 7G），通过 Pearson 相关分析进一步分析了中枢代谢物与已鉴定的中枢基因之间的相关性。有趣的是，这些中枢代谢物均与 MAPK14 和 BMX 呈正相关，与 FCER1A、PAFAH2 和 EPHX2 呈负相关（图 7H）。

本研究用CLP建立了脓毒症大鼠模型，，并使用 MAPK14 拮抗剂 SB203580 对其给药。首先，通过凝胶电泳在脓毒症大鼠心肌组织中证实SB203580对MAPK14的抑制作用(图8A)。与脓毒症组相比，脓毒症后血清促炎细胞因子 IL-1b、IL-6 和 TNF-a 水平显著升高，并通过抑制 MAPK14 下调至 56.7%、64.8% 和 72.6%（图8B-D）。MAP 在 CLP 后 12 小时开始下降，这部分被 SB203580 处理逆转（图 8E）。脓毒症大鼠24h存活率为0，平均存活时间为6.03±4.96h，而SB203580组存活率为18.75%，平均存活时间显著延长至13.28±4.96h 8.173h（图 8F、G）。

器官损伤是脓毒症患者重要的死亡原因，而心肌损伤是脓毒症最严重的并发症之一。为了探讨 MAPK14 拮抗作用对脓毒症心肌功能的影响，本研究观察了脓毒症大鼠心肌纤维的结构变化。败血症后心肌纤维被破坏，纤维之间的空间变宽，这些变化通过抑制 MAPK14 得到改善，如 HE 染色所示（图 8H）。然后通过用 LPS (500 ng/ml) 刺激 H9C2 细胞 12 小时，在体外使用心肌脓毒症模型。SB203580 对 MAPK14 的抑制效果通过蛋白质印迹验证（图 8I、J）。接下来，进行TUNEL染色以观察H9C2细胞的细胞凋亡。与 LPS 诱导的细胞相比，SB203580 处理的 H9C2 细胞中 TUNEL 阳性细胞减少（图 8K）。此外，H9C2 细胞经 LPS 刺激后细胞活力下降 64.6%，而 SB203580+LPS 处理与 LPS 刺激相比细胞活力增加 74.5%（图 8L）。

小编总结

在本研究中，通过机器学习分析确定了 5 个与脂质代谢相关的中枢基因（MAPK14、EPHX2、BMX、FCER1A 和 PAFAH2），这些基因具有诊断和治疗脓毒症患者的可能性。单细胞 RNA 景观显示 LMRGs 可能在脓毒症期间在免疫系统中发挥关键作用。抑制MAPK14对脓毒症的保护作用表明这些脂质代谢中枢基因可能在脓毒症患者的预后预测和精准治疗方面具有巨大潜力。主要缺陷在于MAPK14对单核细胞分化和脓毒症所致心功能障碍的保护作用机制尚不清楚，有待于进一步研究。

来源 | 健康界

版权归原作者所有，若有违规、侵权请联系我们