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导读

戊唑醇是使用最广泛的三唑类杀菌剂之一，据报道，它可能会诱发人类神经系统疾病。考虑到暴露量的增加，是否会影响认知功能还有待进一步研究。本研究使用小鼠模型来评估低浓度戊唑醇连续食用的潜在认知风险和可能的机制。本研究结果表明，戊唑醇会降低谷氨酸受体亚基的表达和空间学习记忆能力。重要的是，宏基因组分析表明，戊唑醇不仅导致肠道微生物群组成和多样性发生显著变化，而且还改变了肠道稳态。具体而言，戊唑醇暴露后，在血液中循环并大量进入肠-脑轴进行破坏，包括干扰厚壁菌门/拟杆菌门比值、相关神经递质和全身免疫因子。此外，益生菌预处理改善了免疫因子的表达，恢复了突触功能以及空间学习和记忆的退化。当前的研究提供了关于肠道微生物组扰动及其功能作为戊唑醇暴露引起的认知功能相关人类健康的潜在新机制的新见解。 

图文摘要

论文ID

原名：Tebuconazole mediates cognitive impairment via the microbe-gut-brain axis (MGBA) in mice

译名：戊唑醇通过微生物-肠-脑轴(MGBA)介导小鼠认知障碍

期刊：Environment International

IF：13.352

发表时间：2023.2

通讯作者：桑楠，李广科

通讯作者单位：山西大学环境与资源学院

DOI号：10.1016/j.envint.2023.107821

实验设计

结果与讨论

1 TEB损害小鼠的空间学习记忆和突触功能完整性 为了评估对认知衰退的影响，我们在实验开始时用LC-MS测定了不同组织样本中的TEB含量，结果如图S1所示。我们首先发现，在不同浓度下暴露后，TEB仍存在于血液、大脑和肠道中；特别是，在非靶器官(大脑)中也检测到较高的TEB残留量。TEB在典型的模式生物中诱导神经病理，学习和记忆能力下降是认知障碍的基本特征。因此，Morris水迷宫测试被用来确定TEB处理是否干扰空间学习和记忆。TEB显著改变了空间训练，高剂量组小鼠学习平台位置的速度比对照组慢(图1A)。在搜索试验中，与对照组相比，通过剂量反应效应，穿过目标区域的次数(图1B)和在目标象限中花费的时间(图1C)在统计学上有所减少，表明TEB损害了空间学习和记忆。

脑源性神经营养因子(BDNF)调节许多涉及神经可塑性和学习记忆的关键脑功能。为了阐明TEB暴露是否会影响神经可塑性，我们首先检测了大脑皮层中的BDNF表达。图1D显示，BDNF的表达随着暴露浓度的增加而下降，在0.02和0.06 g/kg BW的TEB暴露下，对照组和暴露组之间存在显著差异。突触是神经元之间传递、处理和存储信息的基本结构。我们发现突触相关标记物突触素(SYP)(图1E)和蛋白95(PSD-95)(图1F)的表达在TEB暴露后显著降低。考虑到认知功能与突触可塑性和谷氨酸受体功能密切相关，我们进一步检测了α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸(AMPA)受体亚基(GluR1和GluR2)和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体亚基(NMDAR1、NMDAR2A和NMDAR2B)的表达。根据图1G的结果，谷氨酸受体亚基的表达随着浓度的增加而降低，AMPA和NMDA受体亚基在对照组和暴露于0.06 g/kg BW的TEB之间存在显著差异。杀虫剂在诱导谷氨酸受体异常表达和引起突触和认知功能障碍方面也发现了类似的结果。这些结果表明，TEB暴露损害了小鼠的学习和记忆，并降低了突触功能的完整性。

(A) 5天隐形训练的学习曲线。(B)穿过目标区域的次数。(C)花在目标象限的时间百分比。(D) BDNF，(E) SYP，(F) PSD-95和(G) AMPA (GluR1和GluR2)和NMDA (NMDAR1，NMDAR2A和NMDAR2B)的代表性蛋白条带和表达定量。A-C n=14-15只小鼠/组；D-G n=3-6只小鼠/组。*P< 0.05，** P< 0.01。Con=对照组；Low=0.02 g/kg TEB；High=0.06 g/kg TEB。 2 TEB破坏肠道微生物群落结构 最近的报道表明，肠道微生物组与宿主的认知行为密切相关，是调节神经损伤的重要外周机制。有趣的是，许多研究表明，与各种环境压力源接触可能会扰乱宿主的肠道微生物群。为了阐明TEB引起突触功能结构和空间学习记忆紊乱的分子机制，对粪便微生物群组成进行了16S rRNA分析。在所有样本中，计算了10个非单体reads，分别获得5个对照和5个TEB处理的reads。维恩图显示，两组共有7500个OTUs，分别占对照组和TEB处理组全部reads的71.9%和70.2%(图2A)。为了评估样本生态距离的相似性，计算并可视化了未加权非度量多维标度(NMDS)(图2B)和加权主坐标分析(PCoA)图(图2C)的β多样性，表明对照组和TEB组之间的丰度模式发生了变化。利用微生物群落α多样性分析，比较两组间的物种丰富度(Chao1指数、ACE指数)和多样性(Shannon指数、Simpson指数)。TEB处理组的Shannon微生物多样性低于对照组，这表明TEB对微生物群落的干扰作用(图2D-G)。

在门分类水平上，对照组中厚壁菌门(41.78±7.43%)和拟杆菌门(56.84±7.02%)覆盖了主要门，而暴露于TEB后，厚壁菌门丰度显著增加至58.32±7.52% (P < 0.05)，拟杆菌门丰度显著降低至38.13±5.00% (P < 0.01)(图S2-3)。强有力的证据表明，厚壁菌门/拟杆菌门比率(F/B)增加与肠-脑轴异常(如神经精神疾病)之间存在正相关关系。与这一发现一致，之前的研究表明，某些类型的农药和土壤重金属暴露会扰乱这样的肠道微生物群。为了进一步明确TEB在细菌组成分布变化中的作用，我们使用LEfSe比较了不同分类水平下的细菌丰度(图2H和图S4)。令我们惊讶的是，TEB组拟杆菌门(Prevotella，S24_7)的丰度下降。相比之下，TEB暴露后厚壁菌门(Ruminococcus、Oscillospira和Candidatus Arthromitus)、蓝藻门(YS2)和变形菌门(Helicobacter)显著增加。其中Ruminococcus、Oscillosis和Helicobacter与肠道炎症、免疫疾病、甚至神经系统疾病相关。这些结果表明，高浓度TEB暴露可增加F/B比，同时降低有益菌百分比，增加有害菌比例，显著干扰肠道微生物群落结构。 

(A)对照组和TEB处理小鼠OTUs的维恩图。通过非加权NMDS (B)和加权主坐标分析(C)，区分了对照组和TEB处理小鼠的肠道微生物群模式。暴露于TEB对小鼠肠道微生物群丰富度(D-E)和多样性(F-G)的影响。(H)线性判别分析效应量(LEfSe)分析识别的不同组间的差异类群。n= 5只小鼠/组。* P < 0.05。Con=对照组；TEB= 0.06 g/kg TEB。 3 TEB改变了肠道中神经相关的代谢物 一些源自微生物的分子可能操纵不同的肠道功能，包括代谢和免疫反应，甚至与大脑活动相关，导致微生物群介导的中枢神经系统自下而上的效应。神经退行性疾病的特征是进行性神经元退行性变、突触可塑性和神经递质水平改变。肠道微生物组调节神经活性分子的产生，包括经典的神经递质和神经调质，它们通过肠色素细胞或肠神经传递，影响突触(神经元之间)和神经肌肉连接处的信号。在本研究中，PICRUSt的KEGG功能预测分析表明，TEB改变了神经、免疫和其他生物系统(图S5)。然后，我们使用靶向代谢组学分析来评估神经递质的水平。如图3所示，TEB暴露显著提高了抑制性神经递质GABA、微管相关蛋白Tau、褪黑素(MT)和高香草酸(HVA)的表达，降低了犬尿氨酸(Kyn)的表达，并干扰了5-羟色胺(5-HT)的代谢。而谷氨酸(Glu)、色氨酸(Trp)、多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)和乙酰胆碱(ACh)无明显变化。

与这一发现一致，先前的研究表明，农药有助于增加GABA水平，Tau聚合成异常丝状包体是许多神经退行性疾病的基础。此外，认知衰退与MT和HVA改变之间密切相互作用的证据越来越多。重要的是，在肠上皮细胞、免疫细胞和肠染色质细胞中，Trp被代谢为Kyn和5-HT，在体内产生超过95%的5-HT。Kyn具有神经活性，调节神经可塑性和/或通过影响NMDA受体信号转导以及谷氨酸神经传导诱导神经毒性，5-HT与一系列情感、行为和认知功能有关，是许多精神药物的靶点。在本研究中，TEB暴露显著降低了Kyn (0.34倍，P < 0.05)和5-HT (0.22倍，P < 0.05)水平，并显著增强了5-HT代谢物5-HIAA的释放，表明TEB暴露扰乱了肠道微生物群落结构，并通过影响神经递质等代谢物引起认知障碍。

微生物及其代谢产物具有免疫调节功能，可刺激免疫细胞释放信号因子，并进一步作用于大脑，引发一系列生理和精神疾病症状，包括易怒、厌食、抑郁、倦怠和注意力不集中。为了进一步证实，我们检测了在相同暴露水平下肠道、血液和大脑皮层对TEB的免疫反应。如图4所示，TEB剂量依赖性地增加了肠道、血液和皮层中典型免疫因子TNF-α和IL-1β的水平，并且在0.06 g/kg BW时，观察到IL-1β和TNF-α在肠-脑系统中的变化明显。免疫因子在紧密连接功能障碍中发挥着关键作用，而在炎症环境中，功能性肠道微生物的改变已被证明会影响细胞旁通透性，这是许多疾病发病机制中介导的一个关键途径。结合之前的研究结果，TEB引起肠道微生物群组成和多样性的显著变化，最终通过破坏相互连接的神经递质和系统免疫因子对神经系统产生不利影响。

TEB增加(A)肠道，(B)血液和(C)皮层中的TNF-α和IL-1β水平。n = 4-6只小鼠/组)。*P< 0.05，**P< 0.01或***P< 0.001。Low=0.02 g/kg TEB；High=0.06 g/kg TEB。 5 在暴露于TEB后，益生菌预处理抑制免疫反应，恢复突触完整性及空间学习和记忆 益生菌是在肠道和生殖系统定植的活性微生物，有利于身体健康。益生菌VSL#3(含有4种乳酸菌、3种双歧杆菌和1种链球菌的混合益生菌制剂)可以有效调节肠道微生物群，缓解相关疾病的症状。如果TEB通过微生物-肠道-大脑释放免疫因子直接影响肠道微生物，损害突触和认知功能，那么添加益生菌可以减少免疫因子的产生。为了验证这一预测，我们用益生菌预处理细胞，并在TEB暴露后检测肠道-大脑系统中的免疫因子表达。如图5所示，益生菌预处理显著减弱了TEB暴露在血液、大脑和肠道中引起的免疫因子(IL-1β、TNF-α)升高。这些结果表明，益生菌预处理成功抑制了TEB暴露后免疫因子的表达。

随后，我们进一步确定益生菌预处理是否可以恢复突触和认知功能的退化。如图6所示，经益生菌预处理后，TEB减弱的BDNF表达得以恢复(图6A)。同样，益生菌也能阻止TEB诱导的SYP、PSD-95和谷氨酸AMPA和NMDA受体亚基表达的降低(图6B-D)。重要的是，与对照组相比，暴露在TEB环境中的小鼠在益生菌的作用下表现出了行为表现增强，包括成功找到平台的延长潜伏期，穿越目标区域的次数显著提高，以及在目标象限停留的时间增加(图6E-G)。最近的研究报道，万古霉素引起微生物群落的明显变化，并最终损害认知功能。然而，对于TEB暴露是否会影响肠道微生物群结构以及微生物疾病如何介导TEB暴露诱导的认知障碍，我们知之甚少。结合之前的结果，我们的发现进一步证明了肠道微生物通过免疫途径调节肠-脑轴活动，并最终导致TEB暴露后突触和认知功能退化。

(A) BDNF，(B) SYP和(C) PSD-95的代表性蛋白条带和定量表达。(D) AMPA (GluR1和GluR2)和NMDA (NMDAR1， NMDAR2A和NMDAR2B)。(E) 5天隐形训练的学习曲线。(F)穿过目标区域的次数。(G)花在目标象限的时间百分比。A-D，n=3-6只小鼠/组；E-F，n=13-15只小鼠/组。*/#P < 0.05，**/## P < 0.01。Con=对照组；VSL#3= VSL#3组；High=0.06 mg/kg TEB；H+V3=High+VSL#3。 

结论

综上所述，这项研究清楚地表明，TEB可以持续进入肠-脑轴，扰乱大脑和肠道微环境的稳态。重要的是，F/B比值的增加和神经递质的扰动加上免疫应激的激活在这一过程中起着至关重要的作用。本研究结果为阐明TEB的神经毒性作用提供了一种新的机制，并强调了低剂量化学品生物安全性评估对确保环境农药污染物风险评估的重要性。

来源 | 健康界

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