不一样的逆转录-热启动与耐高温

研究表明双链核酸的结构稳定性依次为RNA:RNA> RNA:DNA>DNA:DNA (Biochemistry, Vol. 34, No. 34, 1995)，对于普通单链RNA的逆转录，引物正常与RNA靶标退火，通过常规逆转录酶即可完成cDNA的合成，但是具有双链或二级结构的RNA其特殊的稳定性则阻碍了DNA引物与靶标的结合，导致逆转录效率降低。因此这给进行双链RNA的RT-qPCR检测或测序分析带来了问题：

问题：

为什么有些RNA靶标的RT-qPCR引物设计筛选较困难？

为什么总RNA的cDNA合成存在一定的偏倚性？

为解决这些问题，提高双链RNA和具有二级结构RNA的检测效果，通常有以下三种解决方案：

方案：

采用修饰的引物，提升引物与RNA结合的稳定性

热稳定的逆转录酶，高温打开RNA双链

RNAseH酶靶向水解部分RNA链

或者在逆转录开始之前先加入模板和引物，高温变性之后进行引物退火，再加入逆转录酶体系。但显然该方法会增加操作步骤，使流程更为繁琐增加人工错误的风险。同时也也不能从根本上解决随机引物退火时的偏好性。

那么，针对这些问题与不甚完善的解决方案，我们真的束手无策了吗？答案是：不！并且，让我们把目光转向不一样的逆转录：

1修饰引物解决方案示例

如下图所示，OxyS RNA 存在多处发卡结构，当设计引物从3‘末端进行逆转录时，根据电泳条带，DNA引物无法与靶标退火形成双链复合物，而当DNA引物部分碱基替换为LNA后，由于Tm值的提升，可成功与靶标RNA结合，进而完成逆转录反应（Biochemistry 2009, 48, 514–516）。

2热启动高温逆转录解决方案示例

自然界中存在多种双链RNA病毒具有人畜致病性，如轮状病毒是引起6个月~2岁婴幼儿严重胃肠炎的主要病原体，占病毒性胃肠炎的80%以上。

在过去的一年我们成功推出了一款具有变革意义的RT-qPCR预混液，当市场目光聚焦在可冻干、样本直扩的同时，我们针对RT-qPCR中逆转录酶无法耐受高温的局限进行了革命性的改进，使得全新的一步法RT-qPCR预混液逆转录前可耐受85℃高温，具有独特的热激活逆转录功能，且在60℃-80℃之间保持同样优秀的逆转录活性。

以上特性可以更好的帮助客户避免非特异性扩增、更好的应对复杂RNA模板如二级结构和双链RNA病毒、实现更快的检测速度。

为了验证该预混液针对双链RNA病毒检测的优势，我们进行了如下实验。以A型轮状病毒（呼肠孤病毒科）分离的双链RNA（dsRNA）为模板，与竞争对手C进行比较。轮状病毒dsRNA在每个反应中连续稀释50000–5个拷贝，每个靶点浓度下重复6次。结果如图所示，相比于竞争对手，我们对于低拷贝模板具有更高的检出率。能够很好的帮助客户实现产品性能的进一步提升。

除耐高温逆转录特性之外，该预混液同样兼容可冻干、粗提样本直扩、高灵敏检测低至3拷贝、及多重RT-qPCR。

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来源 | 健康界

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