导语

肺腺癌(LUAD)肿瘤间免疫异质性是免疫治疗临床疗效明显的重要原因。免疫表型(免疫'热'或'冷')提示免疫个体差异和潜在的临床治疗指南。

背景介绍

今天小编为大家带来的这篇文章，作者利用表观基因组特征来确定肿瘤免疫表型和响应性治疗，文章发表在《Briefings in Bioinformatics》上，影响因子为：13.994，文章题目为：Epigenome signature as an immunophenotype indicator prompts durable clinical immunotherapy benefits in lung adenocarcinoma。

数据介绍

本研究主要从TCGA中获取了3级基因表达数据和标准β值DNA甲基化数据。   

技术路线

本研究技术路线如图所示。  

结果解析

01、瘤间免疫异质性揭示了LUAD免疫表型  

本研究引入了五种免疫表达特征（“巨噬细胞”、“淋巴细胞浸润”、“IFN-γ反应”、“TGF-β反应”和“伤口愈合”）来全面描述 LUAD 肿瘤免疫活性。基于这些表达特征的 ssGSEA，本研究计算了每位患者的 iES，随后使用一致性聚类对肿瘤样本进行了分组，总共鉴定了五种强大的免疫亚型（IMC1、IMC2、IMC3、IMC4 和 IMC5）。本研究构建了 UMAP 嵌入聚类以在二维中可视化五种免疫亚型，其中 IMC1 和 2 能够聚类，而 IMC3、4 和 5 倾向于分组（图 1A）。

因此，本研究通过整合肿瘤组织的组织病理学切片(H&E染色)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、免疫活性和免疫表达特征来评估这些免疫亚型的免疫学特征(图1B)。通过用于 TIL 模式的卷积神经网络对 H&E 图像进行计算染色，本研究观察到IMC3、4和5中的TIL模式比IMC1和2中更多，TIMER的肿瘤浸润免疫细胞丰度也支持这一结果(图1B)。本研究还评估了抗肿瘤免疫活性评分，包括ESTIMATE评分、MHC评分、CYT评分和免疫评分，其中IMC3、4、5的四种免疫活性评分均显著高于IMC1、2，提示IMC3、4、5的肿瘤纯度较低，肿瘤细胞抗原提呈能力较强，杀伤肿瘤活性较强，免疫活性较高(图1B)。此外，本研究观察到IMC1和2集中在更高的“伤口愈合”特征上，而IMC3、4和5表现出更多的“巨噬细胞”、“淋巴细胞浸润”、“IFN-γ反应”和“TGF-β反应”特征(图1B)。

图 1

根据上述证据，本研究进一步总结了肿瘤免疫表型如下：IMC1 和 2 属于免疫“冷”表型，反映出较高的肿瘤纯度和较少的 TIL 模式，而 IMC3、4 和 5 则被表征为免疫“热”表型'表型，表现出更高的抗肿瘤免疫活性。本研究还将免疫表型与Bagaev等人定义的四种肿瘤微环境(TME)亚型联系起来，包括免疫增强型、纤维化 (IE/F)、免疫增强型、非纤维化 (IE)；纤维化 (F);免疫耗竭 (D)。本研究发现免疫“热”肿瘤在两种免疫活性 TME 亚型 IE/F和 IE中显著富集，而免疫“冷”肿瘤显著富集于免疫耗尽的 D 亚型（图 1C），进一步突出了 TME 和免疫表型之间的串扰。

02、整体DNA低甲基化的免疫“热”肿瘤生存结果更好 

接下来本研究探索了肿瘤免疫表型的遗传和表观遗传分子特征。本研究在免疫“热”和“冷”肿瘤中均观察到 TMB 总体水平较低（图 1D）。通过计算染色体非整倍性，本研究还发现与“冷”肿瘤相比，免疫“热”肿瘤通常表现出较低的非整倍性评分（图 1E）。除了遗传变异外，作者还研究了表观遗传改变。与“热”肿瘤相比，免疫“冷”肿瘤中存在显著的 DNA 低甲基化水平（图 1F）。这些结果表明，与“热”表型相比，免疫“冷”表型似乎更有可能表现出癌症样分子特征 ，例如更高的染色体非整倍性和更低的 DNA 甲基化水平。本研究进一步构建了 Cox 回归模型，以探索在调整诊断年龄、性别和疾病阶段后免疫表型与患者总体生存概率之间的关联。这一结果表明，与“冷”肿瘤患者相比，“热”肿瘤患者的生存结果更好（图 1G）。这些结果表明，免疫“热”表型是患者预后生存的保护因素。

03、免疫表型特异性表观基因组改变与LUAD发展相关 

为了阐明表观基因组改变在肿瘤免疫微环境中的作用，本研究确定了免疫表型特异性差异甲基化 CpG 位点 (iDMC)，总共确定了 125 个“热”特异 iDMC；14 个“冷”特异iDMC；175 个“组成型”iDMC 在两种免疫表型中均有甲基化差异。本研究进一步将这些 iDMC 与表观基因组范围关联分析 (EWAS) 捕获的特征相关 CpG 位点联系起来 ，这些 iDMC 显著富集于癌症相关、肺相关和免疫相关的特征（图 2A）。此外，本研究将这些 iDMC 分配给它们最近的蛋白质编码基因 (PCG)，并使用 Spearman 相关性检验进一步确定了调控关系。这些 iDMC 通常位于 PCG (260/314) 的转录起始位点 (TSS) 周围 50 kb 以内，约 66.9% 的 iDMC-PCG 对在 TCGA LUAD 队列中的甲基化 β 值和基因表达水平显著相关（图2B)。进一步注释 iDMC 相关 PCG 的生物学功能，本研究发现“热”特异性和“组成型”iDMC 表现在 T 细胞相关免疫反应中、“冷”特异性的 iDMC 表现出与突触信号的相关性，所有三个 iDMC 都显示与发育相关过程的关联（图 2C）。这些结果进一步强调了 iDMC 在 LUAD 发展和免疫调节中的重要性。

图 2

04、DNA甲基化标记可用于免疫表型的查询 

为了更好地审视改变的 DNA 甲基化在 LUAD 免疫表型分析中的作用，本研究通过在 TCGA 训练集上使用机器学习框架确定了一组免疫表型相关的 DNA 甲基化特征（iPMS）（图 3A）。iPMS 由五个 iDMC位点组成，包括四个“冷”位点和一个“热”位点，所有 iDMC 均代表免疫表型特异性高甲基化水平（图 3B）。本研究通过使用 Spearman 相关性检验探索了这些 iDMC 与免疫学特征之间的关联，四个“冷”特异性 iDMC 与除“伤口愈合”之外的所有免疫学特征均呈显著负相关，而“热”特异性 iDMC 则相反（图 3C）。

图 3

接下来本研究构建了一个 iPMS 评分，通过使用反卷积算法来估计患者的临床免疫表型，并应用 iPMS 来预测 TCGA 验证队列中的肿瘤免疫表型。在 TCGA 测试集中，被识别为免疫“热”肿瘤的患者显示出比被识别为“冷”肿瘤的患者更高的 iPMS 分数（图 3D）。与观察到的免疫表型相比，iPMS 预测的免疫表型准确度为 81.2%（图 3E）。这些结果强化了 iPMS 在临床上是一种很有前途的肿瘤免疫表型生物标志物。

05、iPMS对肿瘤免疫分型的疗效评价 

为了进一步评估 iPMS 的稳健性，本研究在五个独立的 LUAD 数据集中验证了iPMS评分与免疫细胞浸润水平之间的相关性。所有验证集均显示 iPMS 评分与免疫细胞浸润水平之间存在显著相关性（图 4A）。CD4+ T 细胞、CD8+ 细胞毒性 T 淋巴细胞和 CD14+ 单核细胞谱系表明，“热”肿瘤的浸润水平普遍高于“冷”肿瘤，这也突出了“热”表型的强免疫活性。iPMS 在通过肿瘤免疫表型分析揭示肿瘤间免疫异质性方面发挥了重要作用。

图 4

本研究进一步证实了 iPMS 预测免疫表型的临床意义。在 322 名患者的 LUAD 队列中 (GSE39279)，本研究发现免疫“冷”患者 (3.41 ± 1.52 cm) 的肿瘤大小明显大于免疫“热”患者 (2.62 ± 1.20 cm) ，肿瘤大小也与患者的 iPMS 评分呈显著负相关（图 4B）。另外在数据集中，本研究对 155 名接受辅助化疗的患者进行了无复发生存 (RFS) 分析，结果发现免疫“热”患者通常比“冷”患者经历更好的化疗结果和更少的复发，这意味着肿瘤免疫表型是化疗益处的潜在指标（图 4C)。此外，本研究通过将 iPMS 应用于 TCGA 放疗队列，观察到免疫“热”患者的生存结果优于“冷”患者（图 4D ）。这些结果表明 iPMS 是区分临床免疫表型的稳定生物标志物，免疫“热”可以作为防止疾病进展的保护因素，肿瘤免疫表型的鉴定也将为患者的临床治疗提供更精准的指导。

06、iPMS和免疫表型相关的免疫检查点有助于疾病进展的风险 

免疫检查点 (ICP) 阻断疗法正逐渐成为抗癌的主要武器。为了更好地了解 iPMS 和免疫表型在免疫治疗中的临床应用，本研究首先确定了免疫表型特异性 ICPs (IPCPs)，它显示出免疫表型特异性差异表达和体细胞突变（图 5A）。分别识别出总共七个“热”和七个“冷”特异 IPCP。本研究接下来通过采用多因素 Cox 回归计算的风险评分来研究这些 IPCP 与疾病进展风险之间的关系，结果发现高 IPCP 风险组的患者经历了晚期疾病进展（图 5B）。同样的结果也出现在 iPMS 风险评分 (iRS) 中（图 5C），这表明 IPCPs 和 iPMS 能够参与疾病进展。因此，本研究进一步探索了基于 IPCP 和 iPMS 风险评分的疾病进展，结果发现 iPMS 和 IPCP 风险评分在所有 14 个 IPCP 中显著相关（图 5D），这意味着在肿瘤进展过程中 iPMS 和 IPCP 之间可能存在串扰。本研究还观察到大多数 IPCP 和 iPMS 能够证明具有免疫“冷”的患者通常患有并发肿瘤发展的高风险，这些结果进一步强调了 iPMS 和 IPCP 在降低肿瘤进展风险方面的能力。因此，本研究还构建了一个 IPCP-药物相互作用网络作为免疫治疗的潜在指南（图 5E），一些著名的用于肺癌免疫治疗的免疫检查点抑制剂都包含在内。

图 5

07、IPMS预测的免疫表型表明持久的抗PD-1/PD-L1免疫治疗益处 

在本研究的 IPCP 中，PD-1 被认为是“冷”特异性 IPCP。针对肿瘤细胞上的 PD1/PD-L1 的抗体介导干预可以逆转肿瘤诱导的免疫抑制，诱导 T 细胞活化并获得持久的临床益处 (DCB)（图 6A）。本研究观察到与“冷”肿瘤相比，免疫“热”肿瘤显示出 CD8+ 细胞毒性 T 细胞丰度与 PD-1/PD-L1 表达之间的高度相关性（图 6B）。另一方面，“热”肿瘤中的 CD8+ 细胞毒性 T 细胞浸润丰度、细胞溶解活性（图 6C）和 PD-1/PD-L1 表达水平（图 6D）也高于“冷”肿瘤。这些结果提示免疫“热”表型可能是免疫疗法 DCB 的关键反应者。为了进一步探索免疫表型在免疫疗法临床获益中的作用，本研究在接受PD-1抑制剂nivolumab或pembrolizumab治疗的60例患者队列中，基于iPMS确定了肿瘤免疫表型，其中11/14的DCB患者被确定为免疫“热”肿瘤(图6E)。

图 6

本研究发现在 DCB 和非持久受益 (NDB) 患者中，免疫“热”患者比“冷”肿瘤表现出更好的免疫治疗结果和更慢的疾病进展，表明“热”表型是免疫治疗的保护因素（图 6F）。本研究还构建了 iRS 来表征患者接受免疫治疗时的疾病进展风险。结果表明，免疫“热”和 DCB 患者的风险通常低于“冷”和 NDB 患者（图 6G）。此外，iRS 在区分 DCB/NDB 方面表现出比突变负荷和非整倍体更出色的性能（图 6G）。这些结果说明 iPMS 和 iPMS 预测的免疫表型是患者免疫治疗获益的强大效应器。

08、iPMIC:一个基于网络的转化平台 

为了方便个性化患者临床治疗指南的定制，本研究开发了一个用户友好的基于网络的翻译平台“iPMIC”。有了这个平台，用户可以上传他们自己的单个样本或样本队列的甲基化概况（图 7A）。iPMIC 将评估患者的免疫表型和免疫细胞浸润水平，并提供潜在的辅助化疗、放疗和抗 PD1/PD-L1 免疫治疗益处的建议。此外，本研究还集成了生存分析工具，用于探索化疗（图 7B）、放疗（图 7C）和抗 PD-1/PD-L1 免疫治疗（图 7D）数据集中免疫表型相关预后结果中的 DNA 甲基化位点。总之，iPMIC是一种在辅助治疗策略的背景下定制肿瘤免疫分型和询问新的表观基因组标志物的实用工具。

图 7

小编总结

本研究首先根据五个免疫表达特征区分了 LUAD 的免疫“热”和“冷”肿瘤。就临床表现而言，免疫“热”肿瘤通常比“冷”肿瘤具有更高的免疫活性、更低的疾病阶段和更好的生存结果。在表观基因组水平，本研究观察到免疫表型之间不同的 DNA 甲基化模式与 LUAD 发展密切相关。因此，本研究确定了一组五个 CpG 位点作为用于肿瘤免疫表型分析的免疫表型相关甲基化特征 (iPMS)，并基于机器学习框架进一步证实了其效率。此外，本研究发现 iPMS 和免疫表型相关免疫检查点 (IPCP) 可能会增加肿瘤进展的风险，这意味着 IPCP 有可能成为一种新的免疫治疗阻断靶点。在进一步分析 iPMS 预测的免疫表型的作用后，本研究发现免疫“热”是一种保护因素，当患者接受抗 PD-1/PD-L1 免疫治疗时，它会导致更好的生存结果。iPMS 在预测持久/非持久临床益处方面也是一个表现良好的特征（AUC = 0.752）。 尽管这些结果为本研究提供了理解免疫疗法持久益处的新见解，但它仍然是在小样本队列中进行的。随着表观基因组数据规模的增长，本研究仍然需要详细剖析其中的关系。

来源 | 健康界

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