消化道肿瘤单细胞转录组测序研究中生物样本前处理改良的探索

杨蕊馨, 杜宇童, 燕然林,朱正纲, 李琛, 于颖彦

摘要

目的：探索在消化道上皮源性肿瘤单细胞转录组测序(简称单细胞测序)中提高组织单细胞悬液中上皮细胞占比的方法，以改善检测样本质量。

方法：分析GEO公共数据库内常见消化道上皮源性肿瘤（胃癌、结肠直肠癌及胰腺癌）单细胞转录组测序数据集中的上皮细胞组分占比。比较传统酶消化法以及酶消化后辅以上机前机械性物理吹打法（改良法）处理后单细胞悬液中上皮细胞占比和细胞活力差异。

结果：分析公共数据库内数据显示，4份正常胃上皮及胃癌样本的上皮细胞占比为17.05%、6.11%、8.93%和14.66%; 2份结肠直肠癌上皮细胞占比为3.86%和16.60%；2份胰腺癌上皮细胞占比为3.22%和21.37%。对2份新鲜采集的胃癌样本，采用传统酶消化法制备单细胞悬液的细胞结团率为56.26%±1.98%和38.34%±1.26%，细胞活力检测提示活细胞占比分别为98.43%±0.56%和97.24%±0.48%；而对传统酶消化法处理后的单细胞悬液在上机前用0.33 mm规格的胰岛素注射器施以机械性吹打操作30 s，可使单细胞悬液的上皮结团率降至22.78%±1.38%和14.46%±0.92%（P均<0.000 1）；活细胞占比分别为95.16%±0.42%和93.52%±0.82%（P<0.05）。

结论：在采用传统酶消化后辅以机械性物理吹打法的组织样本前处理操作，可减少上皮细胞结团，从而提高单细胞悬液中的上皮细胞占比，活细胞占比虽有小幅下降，但可满足上机要求。

图1

胃上皮及胃癌数据集中细胞成分占比分析 注：B淋巴细胞群、T淋巴细胞群等统称为非上皮细胞群。A：胃黏膜样本1中的cluster 1群属于上皮细胞群，EPCAM、KRT18和KRT8呈高表达；右侧图显示上皮细胞占比（黑线圈出细胞群）并不高；B：胃黏膜样本2中的cluster 4、5为上皮细胞群，右侧图示上皮细胞占比较低（黑线圈出细胞群）；C：胃癌样本1中的cluster 3为上皮细胞群，右侧图显示上皮细胞占比较低（黑线圈出细胞群）；D：胃癌样本2中的cluster 4、5为上皮细胞群，右侧图示上皮细胞占比较低（黑线圈出细胞群）；E. 胃黏膜样本1、胃黏膜样本2、胃癌样本1及胃癌样本2的单细胞测序数据集中上皮细胞成分和非上皮细胞成分占比详细情况。

图2

结肠直肠癌数据集中细胞成分占比分析 注：B淋巴细胞群、T淋巴细胞群等间充质细胞统称为非上皮细胞群。A：样本1中的cluster 5为上皮细胞群，在右侧图中占比较低（黑线圈出细胞群）；B：样本2中的cluster 7为上皮细胞群，在右侧图中占比较低（黑线圈出细胞群）；C：样本1、2的单细胞测序数据集中上皮细胞成分和非上皮细胞成分占比详细情况。

图3

胰腺癌数据集中细胞成分占比分析 注：淋巴细胞群等间充质细胞统称为非上皮细胞群。A：样本1中的cluster 4为上皮细胞群，在右侧图中可见占比较低（黑线圈出细胞群）；B：样本2中的cluster 2为上皮细胞群，在右侧图中可见占比较低（黑线圈出细胞群）；C：样本1和2的单细胞测序数据集中上皮细胞成分和非上皮细胞成分占比详细情况。

图4

胃癌组织胶原酶消化制备的单细胞悬液细胞结团情况 A：胃癌组织经胶原酶消化后，细胞悬液低倍镜下可见较多消化不彻底的上皮细胞团；B：结团上皮细胞的局部放大；C：单细胞悬液中的单个细胞、两细胞团、三细胞团、五细胞团及多细胞团的显微镜下特征以及对应的模式图。

图5

传统样本前处理法与改良前处理法的胃癌单细胞悬液结团率比较 A、B：AO染料荧光染色；左侧为低倍镜，右侧为高倍镜；上方、下方分别为传统法及改良法前处理的细胞悬液；A为样本1，B为样本2，可见上方图中上皮细胞结团明显，下方图中上皮呈游离单细胞状态。

图6

胃黏膜与胃癌组织单细胞悬液制备流程图 A：上皮组织与间充质细胞的分布情况；B：胶原酶消化形成的细胞悬液中上皮细胞多数结团存在；C：在胶原酶消化基础上辅以机械力解离，可获得低结团率且保有高细胞活力的单细胞悬液。  

杨蕊馨, 杜宇童, 燕然林,等.消化道肿瘤单细胞转录组测序研究中生物样本前处理改良的探索[J].诊断学理论与实践，2022，21 (5): 567-574.

YANG R X, DU Y T, YAN R L,et al. Improving exploration of biological sample pretreatment in single-cell transcriptome sequencing of gastrointestinal tumors[J]. J Diagn Concepts & Pract, 2022, 21(05): 567-574.

通讯作者

于颖彦 YU Yingyan

上海交通大学医学院附属瑞金医院教授/博士生导师，上海消化外科研究所副所长，中国抗癌协会胃癌专业委员会常委，中国医药生物技术协会生物样本库分会及慢病管理分会常委。上海市浦江人才与上海市优秀学术带头人。主要从事消化病理、肿瘤分子分型、胃癌生物标志物和转化医学研究。

来源：上海瑞金医院期刊编辑部

来源 | 健康界

版权归原作者所有，若有违规、侵权请联系我们